Como melhorar a sensibilidade da reação RT-PCR para detecção de RNA

No processo de realização de estudos genéticos, muitas vezes encontramos amostras de RNA insuficientes, por exemplo, para estudar minúsculos tumores orais anatômicos, mesmo amostras de células únicas e amostras de mutações genéticas específicas que são transcritas em níveis muito baixos em células humanas.Claro, para o teste COVID-19, se os swabs não estiverem no lugar certo ou não forem suficientes durante a amostragem, o tamanho da amostra será muito baixo, por isso a Comissão de Saúde e Planejamento Familiar saiu há dois dias e passou no teste e, se o amostrador de ácido nucleico não colheu seis amostras, você pode denunciá-lo.

A sensibilidade do reagente é importante porque temos este ou aquele problema, então o que podemos fazer para melhorar a sensibilidade do RT-PCR?

Antes de discutirmos possíveis soluções, vamos mencionar duas grandes complicações com a situação que acabamos de mencionar.

Em primeiro lugar, nos preocupamos com a perda de RNA quando temos apenas algumas populações de células em nossa amostra.Se métodos tradicionais de separação e limpeza forem usados, como método de coluna ou método de precipitação de ácido nucleico, há uma grande possibilidade de que algumas amostras sejam perdidas.Uma solução é adicionar uma molécula transportadora, como tRNA, mas mesmo assim, não há garantia de que nosso experimento de recuperação esteja OK.

Então, qual é a melhor maneira?Uma boa opção para células cultivadas ou amostras microanatômicas é usar a lise direta.

A ideia é dividir as células por 5 minutos, liberar o RNA na solução, depois parar a reação por 2 minutos, depois adicionar o lisado diretamente na reação de transcrição reversa para que nenhum RNA seja perdido e, por fim, colocar o cDNA resultante diretamente na reação em tempo real.

Mas e se, devido a um ponto de partida limitado ou a uma pequena quantidade de expressão do gene alvo, pudermos reciclar todo o RNA e ainda não fornecer modelos suficientes para obter um bom sinal em tempo real?

Nesse caso, a etapa de pré-amplificação pode ser muito útil.

O seguinte é um esquema para aumentar a sensibilidade após a transcrição reversa.Antes de começar, precisamos perguntar a jusante quais alvos nos interessam, de modo a projetar primers específicos para esses alvos para pré-amplificação.

Isso pode ser obtido criando um primer misto com até 100 pares de primers e um ciclo de reação de 10 a 14 vezes.Portanto, um Master Mix projetado especificamente para este requisito é necessário para pré-amplificar o cDNA obtido.

A razão para definir o número de ciclos entre 10 e 14 é que esse número limitado de ciclos garante a aleatoriedade entre os vários alvos, o que é crucial para pesquisadores que precisam de informações moleculares quantitativas.

Após a pré-amplificação, podemos obter uma grande quantidade de cDNA, de modo que a sensibilidade de detecção no back-end seja bastante aprimorada, e podemos até diluir a amostra e realizar várias reações de PCR em tempo real para eliminar possíveis erros aleatórios.